1、蛋白条带呈梯形，波浪形，微笑形
✅可能原因：
电泳液过于陈旧，或者配制有问题；
电泳液成分比例不正确（若是自己配置）；
蛋白胶未及时保湿or胶放太久上层胶变干。
2、某个条带变形
✅可能原因:
胶体未完全聚合;
胶内含有颗粒或气泡;
配胶容器or玻璃板等材料未清洗干净。
3、条带呈哑铃状
✅可能原因:
胶没有配置好，胶凝固不均匀;
蛋白样品中杂质太多，裂解后未离心，将蛋白挤在两边。
➡️(只要条带清晰，趋势明显，背景不高，这种 情况并不影响条带的使用，可以作为数据)
‼️以上均为蛋白胶的配置问题，解决办法:
胶最好现配现用;
玻璃板和插胶的梳子使用前清洗干净，且⻛干后再使用;
配胶液从4度冰箱拿出来后放置10分钟，使其恢复室温再进行配置
（预制胶不用考虑这条)
配胶液充分混匀后再倒入玻璃板。
4、蛋白条带“飘走了”
✅可能原因:
转膜时，三明治结构的转膜夹不够紧;
转膜过程中放热太多导致蛋白弥散;
电源不好用or电压电流不稳定。
5、条带模糊， “毛玻璃样”，边界不清晰， 或者不成条带形状
✅可能原因:
转膜时，三明治结构有问题;
电泳用的蛋白胶配置错误;
转膜过程中放热太多;
转膜滤纸过于陈旧，或不平整，坑坑洼洼，
纸屑太多。
❗️属同一类问题，解决办法:
忌过于松垮，陈旧的转膜夹，务必夹紧再放入槽中，微紧即可;
湿转法使用冰水混合物，湿转液提前预冷1小时左右，可放负20;
转膜用日常使用时电压较稳的电源。
6、蛋白条带相连，“手拉手”
✅可能原因:
上样量过大，这里主要指蛋白质量过高，上样体积过大也可能因为泳道的挤压出现此问题;
一抗孵育时间过⻓;
一抗浓度过大;
曝光时间过⻓(图上例子不是这个原因);
蛋白样品盐离子浓度过高。
❗️解决办法:
蛋白浓度尽可能高，减少上样量;
一抗孵育4度过夜12小时，不好孵育的一抗可敷24小时;
上样量很多时，采用1.5mm的玻璃板或者大孔胶。
7、可以看到条带，但泛白
✅可能原因:
样品蛋白浓度过高，导致信号过强;
一抗or二抗浓度过高，信号过强，曝光过度，导致反白现象;
曝光时间过⻓，也可能导致图像过曝，呈白色发光。
❗️解决办法:
降低上样量，或者稀释样品;
稀释一抗or二抗，根据实际情况判断是哪种试剂浓度过高;
稀释发光液，可以用TBST或PBS稀释，或者换低敏发光液。
8、膜上有黑斑
✅可能原因:
PVDF/NC膜存在污染;
封闭液污染，或者封闭膜的容器不干净，有脏东⻄;
未充分激活膜，或者局部激活后又干燥过。
❗️解决办法:
封闭盒，抗体孵育盒使用前冲洗干净;
手套保持干净，尽可能不要碰到膜的正面;
膜使用前充分激活，由白色变半透明即可使用，不要放置在外面过久使其变干燥。
9、蛋白marker被染色
✅可能原因:
一抗与marker非特异性结合，若像
示例图一样，条带清晰，建议更换marker，一抗不用换;
若条带不清晰，marker也被染色，建议更换一抗。
❗️解决办法:
更换一抗或者蛋白marker，此为预染蛋白和抗体非特异性结合。
10、无条带，白板现象
✅可能原因:
蛋白降解(提取蛋白时加蛋白酶体抑制剂，样品反复冻融)
蛋白浓度过低; 转膜转反;
二抗属性孵错;
发光液失效。
❗️解决办法:
活性较强的蛋白提取时加抑制剂;
丰度较低的蛋白增加上样量，制备蛋白样品时多收点细胞;
转膜注意过程，插电前仔细确认正负极;
使用超敏发光液。
11、最左侧or最右侧条带形状不一致，翘边
✅可能原因:
边缘效应，胶的最左侧or最右侧上蛋白样品导致，如图所示：
上图15孔胶第一个泳道上样后导致翘边，
下图15孔胶第一个泳道上蛋白marker，样品从 第二个泳道开始，则没有这个问题。
❗️解决办法:
最左侧or最右侧空开，不上样品，可以补loading buffer;
最左侧or最右侧上蛋白marker。
12、封闭效果不佳，且有气泡
✅可能原因:
转膜三明治结构出现气泡;
封闭液用量不足或浓度过低;
封闭时间过短;
封闭液选择不当;
(不同的蛋白可选择不同的封闭液，例如磷酸化 蛋白不建议使用脱脂奶粉)
发光液没有充分浸泡PVDF/NC膜。
❗️解决办法:
转膜时仔细赶走膜与胶之间的气泡;
脱脂奶粉封闭时可适当提高浓度，例如6%;
封闭完可用tbst漂洗10min后再敷一抗;
选择快速封闭液或者尝试BSA封闭；
重新涮发光液，时间可久一些，使其均匀分布在膜上。
13、膜上存在黑色细小颗粒，和细小黑斑
✅可能原因:
封闭液为溶解充分;
脱脂奶粉变质析出，形成固体“奶盖”，还在使用;
一抗和封闭物进行了结合反应。
(脱脂奶粉封闭容易出现的现象)
❗️解决办法:
此为脱脂牛奶封闭常⻅问题，建议重新配牛奶，溶解牛奶时间延⻓，以免有颗粒物。
14、杂带过多，未⻅明显特异性条带，且有 纵向纹理
✅可能原因:
一抗特异性太差;
一抗不新鲜，使用次数过多;
封闭不够彻底;
样品不纯，存在不溶性颗粒。
❗️解决办法:
更换一抗，蛋白样品裂解后离心。
转速和时间为:12000rpm*30min。
15、背景高，见明显特异性条带，但不干净
✅可能原因:
一抗不新鲜，使用次数过多(可能性最大);
封闭不够彻底;
封闭液不好用。
❗️解决办法:
配新的一抗，换封闭液，或者新配封闭液。
16、条带中间泳道部分变浅，或呈现空心状
✅可能原因:
对应泳道蛋白浓度过高，导致发光底物消耗;
膜上的发光液不均匀;
转膜三明治结构有问题。
❗️解放办法：
检查是否是因为个别样品浓度过高所致，如果是，稀释样品，调 ⻬蛋白浓度即可;
重新滴发光液，可把膜充分浸泡在发光液中大概5-10s，必要时可用1ml移液枪辅助；
把发光液均匀的淋到膜上，使其均匀分布;
转膜时避免“汉堡样”，三明治结构微紧即可，切勿过紧，使其鼓包。
17、条带形状不一，大小不同
✅可能原因:
上样体积相差过大;
样品的loading buffer浓度相差过大。
❗️解决办法:
尽可能保持上样量一致，相差1-2μl没问题，若因为内参等问题必须上样不同，上样少的泳道可用loading buffer补⻬到一致的体积;
制作蛋白样品时，同一组样品使用同一来源的loading buffer，浓度也最好一致，不同浓度的loading buffer甘油含量不一致，泳道间可 能会相互挤压，从而导致条带宽窄不一。
18、若以上问题都没有，那么请注意接下来的这个要点❗️
发光时，在趋势明显，条带清晰的前提下，曝光越短越好（上图），不建议长曝光作为数据（下图）。
