背景介绍
肿瘤细胞通过免疫抑制分子（如PD-1/CTLA-4）逃避免疫监视，但免疫检查点抑制剂（ICIs）的疗效仍有限，部分患者无法获得持久响应。肿瘤微环境（TME）中的代谢异常（如低氧和高糖酵解）会损害T细胞功能，而线粒体功能障碍可能进一步削弱抗肿瘤免疫。然而，T细胞线粒体损伤的具体机制，尤其是肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）中线粒体DNA（mtDNA）突变的作用，尚不清楚。此外，肿瘤细胞是否通过线粒体转移影响TILs功能，仍有待研究。
2025年2月，千叶癌症中心研究所Yosuke Togashi的团队在Nature（IF：50.5）杂志上发表了题为Immune evasion through mitochondrial transfer in the tumour microenvironment的文章,研究通过全基因组测序分析发现，肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）中存在与邻近肿瘤细胞完全匹配的mtDNA突变谱。体外共培养实验证实，荧光标记的肿瘤细胞线粒体可通过隧道纳米管（TNTs）转移至T细胞，转移效率达15-20%。肿瘤来源的突变线粒体因携带自噬抑制分子而逃逸降解，导致T细胞代谢紊乱、功能衰竭和衰老。临床分析显示，黑色素瘤和非小细胞肺癌（NSCLC）患者的肿瘤mtDNA突变与ICI治疗预后不良相关。该研究揭示了肿瘤细胞通过线粒体转移逃避免疫的新机制，为优化免疫治疗策略提供了新靶点。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41586-024-08439-0
主要内容
1. TILs及癌细胞中的线粒体DNA突变
为探究TILs线粒体功能障碍机制，该研究对12例癌症患者TILs进行mtDNA测序，发现5例存在突变（图1a）。TILs主要由CD45⁺CD3⁺ T细胞组成，排序T细胞与TILs共享突变（图1b, c）。在7例患者中建立配对肿瘤细胞系，4例TILs存在突变，3例与肿瘤细胞突变一致（图1a, c）。从突变样本中分离出野生型T细胞克隆TIL04#9。电子显微镜显示，携突变的TILs与肿瘤细胞线粒体嵴减少、形态异常，野生型样本及其配对PBL线粒体形态正常（图1d）。患者04石蜡包埋肿瘤组织中检测到相同突变，证实突变并非源于培养过程（图1e）（图1）。
图1 TILs与肿瘤细胞存在共享的突变mtDNA线粒体
2. 癌细胞向T细胞的线粒体转移
该研究推测TILs与肿瘤细胞共享的mtDNA突变可能来源于线粒体转移。为验证此机制，研究引入线粒体特异性荧光蛋白MitoDsRed分别标记携带野生型mtDNA的MEL02和突变型mtDNA的MEL04细胞。共培养结果显示，转移在前24小时内极少发生，24小时后则明显增强（图2a,b）。转移效率与mtDNA状态无关。
为明确转移路径，研究考察了胞间纳米管（TNT）和细胞外囊泡（EVs）在转移中的作用（图2c）。应用TNT抑制剂cytochalasin B、不同孔径的共培养插板（3 μm和0.4 μm）以及小EV释放抑制剂GW4869均显著减少转移水平（图2c）。联合使用这些干预手段未进一步增强抑制效果，提示主要抑制机制来自阻断TNT介导的细胞接触。大囊泡抑制剂Y-27632抑制作用较弱，提示小EV在转移中更为关键（图2c）。
进一步分离纯化200 nm以下的EVs，发现其同时含有线粒体蛋白cytochrome c及小EV标志物CD9和TSG101，证实小EV可携带线粒体。综上，TILs可通过TNT直接接触及小EV间接机制，从癌细胞获得mtDNA突变（图2c）（图2）。
图2 肿瘤细胞突变线粒体转移至TILs并实现同质化替代
3. 线粒体同质化替代
该研究探讨了肿瘤细胞转移线粒体到T细胞后是否会引发同质化替代（homoplasmy）。将TIL04#9与MEL04共培养后，部分T细胞在15天后发生了mtDNA完全替代（图2d）。实时成像显示，T细胞中线粒体标记（MitoTracker Green）信号减弱，而癌细胞来源的DsRed信号逐渐增强，最终Green信号完全被替代，提示线粒体同质化发生并持续存在（图2e,f）。在体内实验中，注射携带13997G>A突变的LLC/A11-MitoDsRed肿瘤细胞到小鼠，发现21和42天时TILs中DsRed⁺ T细胞比例逐渐升高，证实癌细胞向T细胞转移线粒体（图2g,h）。单细胞测序表明，DsRed⁺ T细胞携带突变mtDNA，部分为同质型（图2i）。
进一步分析显示，T细胞线粒体信号减少（图3a），而癌细胞向T细胞的线粒体转移增强（扩展图1f）。流式检测发现癌细胞释放的EVs中含有ROS（扩展图2f），NAC处理可清除ROS并阻止T细胞线粒体减少及同质化替代的发生（图3b,c）。NAC还抑制了LC3B阳性信号增强，提示ROS诱导的自噬作用（图3d,e）。突变型TILs中BNIP3和ATF4表达上升，反映线粒体应激和自噬活性增加（图3f）。自噬抑制剂Bafilomycin A1可防止T细胞线粒体丢失（图3g）。
研究发现，癌细胞转移的线粒体对自噬具有耐受性，而T细胞的内源性线粒体则易被癌源ROS引发自噬并被替代。进一步分析表明，肿瘤细胞中的USP30可能是赋予转移线粒体抗自噬能力的分子。USP30在癌细胞中高表达，在突变的TILs中略增，而在野生型TILs和PBLs中低表达（扩展图2i）。共培养后，USP30随线粒体一起转移至TILs（图3h,i）。USP30抑制剂CMPD-39部分减少线粒体转移，并阻止同质化替代（图3j,k）。这些结果表明，USP30等自噬抑制分子使癌细胞转移的线粒体不经历自噬，而T细胞内源性线粒体因ROS作用而经历自噬，最终导致线粒体替代（图2，3）。
图3 肿瘤细胞线粒体通过USP30抵抗线粒体自噬
4. 突变T细胞中的线粒体功能障碍
在TILs的功能分析中，发现与野生型MEL02-MitoDsRed或突变型MEL04-MitoDsRed共培养的TILs中，突变mtDNA的TILs（DsRed TIL04#9/04细胞）表现出显著降低的线粒体膜电位（图4b），并伴随ROS的显著增加（图4c）。mtDNA损伤通过抑制复合物IV或V，增加ROS生成，进而通过改变电子传递链的还原状态，引发ROS的产生。
进一步分析发现，突变的mtDNA使得TILs中β-半乳糖苷酶活性和衰老分子p16、p53水平升高（图4d–f），并导致CD27–CD28–衰老表型及IL6、CXCL8、IL1B等分泌水平增加（图4g–j）。此外，DsRed TIL04#9/04细胞表现出更低的分裂潜力和更多的凋亡（图4k,l）。mtDNA突变TILs中的CCR7highCD45RAlow中枢记忆细胞和KLRG1low长寿命细胞比例显著减少（图4m,n）。
通过共培养PBL中分选出的CCR7highCD45RAhigh初始CD8 T细胞与MEL02-MitoDsRed或MEL04-MitoDsRed细胞，发现突变T细胞的中枢记忆细胞和长寿命细胞减少。此外，抗CD3和CD28刺激后，突变TILs中的PD-1和CD69表达显著减少，提示mtDNA突变抑制了T细胞的有效激活（图4o,p）。类似的结果也出现在乳腺癌细胞（MEL02和MEL04）共培养的TILs中（扩展图4a–l）。使用USP30抑制剂或靶向USP30的siRNA治疗，部分恢复了TIL功能。
进一步研究表明，癌细胞来源的mtDNA突变线粒体转移到T细胞后，导致T细胞衰老、功能缺陷及记忆形成受损，伴随代谢异常 (图4)。
图4 线粒体转移导致TILs功能受损
5. 体内转移与抗肿瘤免疫
该研究进一步探讨了线粒体转移对体内抗肿瘤免疫的影响。将MitoDsRed引入LLC/P29细胞后，在小鼠体内分析TILs，CD8 T细胞的浸润在LLC/P29与LLC/A11肿瘤间相似，并且肿瘤浸润的CD8 T细胞中DsRed信号也相似，表明线粒体转移（图5a）。从TILs分选出的DsRed T细胞显示LLC/A11细胞的突变SNP（13672A>T），而野生型LLC/P29中未见此突变。接收LLC/A11突变mtDNA线粒体的DsRed CD8 T细胞表现出更高的β-半乳糖苷酶活性和更高的凋亡率（图5b,c），并且CD127highKLRG1low长寿命记忆前效应T细胞（MPECs）减少（图5d）。与LLC/P29肿瘤的DsRed CD8 T细胞相比，LLC/A11肿瘤中的mtDNA突变T细胞PD-1表达显著减少，表明其激活效率低下（图5e）。
进一步分析表明，mtDNA突变的CD8 T细胞在LLC/A11肿瘤中表现出更显著的衰竭表型，包括高TIM3和低TCF1表达（图5f）。采用OT-1小鼠移植LLC/P29或LLC/A11肿瘤后，从TILs中分选的DsRed CD8 T细胞对OVA过表达癌细胞的杀伤能力减少，尤其是mtDNA突变的LLC/A11细胞（图5g）。CD8 T细胞耗竭促进LLC/P29肿瘤生长，但对LLC/A11肿瘤影响较小。此外，LLC/P29细胞在体外比LLC/A11细胞生长更快，表明突变的mtDNA通过线粒体转移导致T细胞功能丧失，减弱了抗肿瘤免疫。
进一步研究发现，GW4869处理减少了肿瘤中的线粒体转移，导致β-半乳糖苷酶活性和凋亡减少（图5i–k），并增加了MPECs和PD-1 CD8 T细胞的频率（图5l,m）。GW4869还逆转了衰竭表型，从终末分化转变为类干细胞的衰竭（图5n），并且抑制了LLC/A11肿瘤生长，但对LLC/P29肿瘤无影响（图5h）。在免疫缺陷小鼠中，GW4869对LLC/A11肿瘤生长没有影响。
采用SCID小鼠进行的体内T细胞转移实验显示，OT-1小鼠转移的DsRed CD8 T细胞在LLC/A11-OVA肿瘤中PD-1表达较低，且表现出更显著的衰竭表型。这些T细胞对LLC/P29-OVA肿瘤具有抗肿瘤作用，而对LLC/A11-OVA肿瘤则无效。综上所述，从癌细胞转移的mtDNA突变线粒体可通过T细胞功能丧失，降低体内抗肿瘤免疫，包括PD-1阻断介导的免疫反应（图5）。
图5 含突变mtDNA的线粒体转移削弱体内抗肿瘤免疫
6.线粒体功能与免疫检查点抑制疗法（ICI）疗效
该研究使用条件性敲除小鼠（Tfamfl/flCd4cre）模型研究T细胞线粒体功能障碍。T细胞的线粒体质量减少，基础线粒体呼吸降低，糖酵解依赖性增加，且T细胞衰老（图6a–d）。PD-1阻断在这些小鼠中疗效显著减弱（6e），阻断后对照小鼠的CD8 T细胞功能改善，而Tfamfl/flCd4cre小鼠无明显变化（图6f–h）。
复挑战实验显示，抗PD-1治疗完全清除初始肿瘤的小鼠，在接受相同癌细胞复挑战后，对照小鼠大多数肿瘤被排斥，但Tfamfl/flCd4cre小鼠有一半以上的肿瘤未被排斥（图6i）。这些小鼠的TILs中衰老的CD8 T细胞比例增加，记忆前效应T细胞（MPECs）比例减少（图6j,k）。
临床数据分析显示，黑色素瘤和NSCLC患者中携带mtDNA突变的患者PD-1阻断后无进展生存期显著短于无突变患者（图7d），而在未接受ICI治疗的NSCLC患者中，mtDNA突变对预后无显著影响（图7e）。这些结果表明，转移的mtDNA突变线粒体通过影响T细胞功能，削弱抗肿瘤免疫，降低ICI疗效（图6，7）。
图6 小鼠体内线粒体功能障碍实验数据
图7 肿瘤组织中的mtDNA突变损害PD-1阻断治疗效果
研究总结
这项研究通过mtDNA测序、体外共培养实验、单细胞分析等方法证实了肿瘤细胞通过隧道纳米管和小细胞外囊泡向T细胞转移线粒体，导致T细胞线粒体完全替代。研究首次阐明了肿瘤细胞通过线粒体转移逃避免疫监视的机制，发现转移的线粒体携带自噬抑制分子USP30，从而逃避降解。该研究还揭示了mtDNA突变线粒体导致T细胞代谢异常、功能衰竭和衰老，并为免疫治疗耐药提供了新的靶点。研究发现，USP30抑制剂和GW4869处理能够恢复T细胞功能，显著提高肿瘤消退率，具有为开发联合靶向线粒体转移的免疫治疗策略奠定理论基础的重要意义。
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