WB几乎是广大科研人的必修实验技术，普通蛋白的WB或许可以做的得心应手，但是做磷酸化蛋白WB经常会出现曝不出条带的情况！
WB检测蛋白质磷酸化其实和跑正常蛋白的大体步骤没什么出入，只不过孵育的是识别磷酸化的抗体；同时由于磷酸化蛋白反应快，降解快，表达量少，也有非常多的小细节需要格外注意！
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Part.1
蛋白质磷酸化背景知识
蛋白质是组成...细胞、组织的重要成分，新的蛋白质多肽要转变为成熟蛋白质，需要经过蛋白翻译后修饰。
翻译后修饰包括：磷酸化、糖基化、甲基化、羟基化、脂酰化、羧基化等共价修饰。其中蛋白质磷酸化是重要的蛋白质翻译后修饰之一。
蛋白质磷酸化由蛋白质激酶所催化，磷酸化多发生在多肽链丝氨酸，苏氨酸的羟基上，偶尔也发生在酪氨酸残基上，这种磷酸化的过程受细胞内一种蛋白激酶催化，磷酸化后的蛋白质可以增加或降低它们的活性。
例如：促进糖原分解的磷酸化酶，无活性的磷酸化酶b经磷酸化以后，变成有活性的磷酸化酶a。而有活性的糖原合成酶I经磷酸化以后变成无活性的糖原合成酶D，共同调节糖原的合成与分解。
蛋白质磷酸化是一种动态的生物调节过程，磷酸化涉及细胞信号转导、神经活动、肌肉收缩以及细胞的增殖、发育和分化等生理病理过程。
在细胞中，大约有1/3的蛋白质被认为是经过磷酸化修饰的。由激酶催化的磷酸化和由磷酸酶催化的去磷酸化是控制细胞周期的关键。细胞周期调控途径由一系列激酶和磷酸酶组成，它们通过将途径的下一个底物磷酸化和去磷酸化而对外来信号和检验点做出反应。
Part.2
WB检测蛋白质磷酸化
WB（蛋白质免疫印迹法）是定性测量蛋白质磷酸化水平的金标准。通过SDS-PAGE分离蛋白质后，当施加电压时，蛋白质从凝胶转移到膜上。通过将识别目标蛋白质磷酸化的抗体添加到膜中。然后，磷酸化抗体与辣根过氧化物酶 （HRP）偶联的二抗结合。当添加HRP底物时，可以检测到抗体结合了磷酸化的蛋白质，从而产生化学发光。
详细的WB实验教程可以看这篇文章：
以下内容重点分享磷酸化蛋白的WB检测重点注意事项，祝大家的实验成功率UP UP UP !
1、样品制备重点
① 先弄清楚样品中磷酸化蛋白表达情况
可以利用 PhosphoSitePlus 数据库查询蛋白的磷酸化情况。PhosphoSitePlus当中关于翻译后修饰的信息主要来自于具体的实验结果以及高通量测序的预测，包括磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化等。可以查阅修饰类蛋白的表达条件和丰度、刺激方式等。
样品的磷酸化水平表达一般都非常低，有些甚至不表达，这个时候可通过物理或化学方法进行一定的刺激和诱导，刺激条件各不相同，刺激的时间和强度需要自己查文献和进行预实验来确定，要确保这个样品本身能检测出目的蛋白。
注意，刺激并越多越好，要做到充分但不过分（如磷酸化IRS1，仅需刺激5min，刺激过久会进入负反馈机制进而开始降解），正确刺激会帮助我们得到最佳实验结果。
有合适的阳性对照至关重要，在任何实验中，我们都应考虑包含适当的阳性和阴性对照，可以进一步确定抗体检测到的特异性信号。
如CST官网就有详细的刺激方法和阳性对照：
链接：https://www.cellsignal.cn/learn-and-support/control-treatments-by-target
② 磷酸化蛋白样品提取&保存
取样要快、准、冷
蛋白的磷酸化是一个非常迅速的反应，磷酸化蛋白在室温条件下很容易被蛋白磷酸酶降解，即便加入磷酸酶抑制剂也很明显。所以取样品的过程要迅速，样品要新鲜（新鲜的样品制备提取物背景较低）。
样品处理最好在全程冰上操作，操作时间尽量短。用PBS洗涤细胞时，PBS一定要4 ℃预冷。如果是组织的话，提取蛋白时采用液氮研磨的方法，研磨器具最好提前预冷，保持低温的状态。
抑制磷酸酶的干扰
提取磷酸化蛋白的裂解液最好是新鲜配制，现配现用。
裂解液中一定要有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，因为组织或细胞裂解时会释放出大量内源性蛋白磷酸酶，它可以催化磷酸化蛋白的去磷酸化，否则即使条带压出来也会很浅，结果也不可信（okadaic acid，NaF磷酸酶抑制剂）。
外源性的磷酸酶主要是由实验过程中的其它试剂带入的，比如要确保实验试剂中不含磷酸酶等；此外，样品中或其它试剂中带的细菌也会分泌外源性的磷酸酶，所以另一个关键是要尽量使用无菌清洁的试剂和凝胶，必要时加入防腐剂。
弄清检测的蛋白磷酸化位点是什么氨基酸
如果是酪氨酸还要加1?mol/L的 Na3VO4（原钒酸钠）。有些磷酸化抗体会注明上样前不要煮沸，煮沸可能会破坏其磷酸化位点。
裂解液裂解 超声处理可确保整个细胞充分裂解并剪切染色质DNA
经过超声处理过的样本得到的结果更清晰。建议在35%-40%的功率输出条件下超声3次，每次10s。由于不同仪器不...能，要根据生产商的建议进行优化。超声处理时应保持低温，冰上操作。如果没有探头超声仪，也可以用细的注射器针头反复吹打也能起到类似的作用。
提取的磷酸化蛋白一定要妥善保存
最好是收集完成后马上变性并于-80℃分装保存，以保证降解程度最小。同时避免反复冻溶导致磷酸基团的降解。
2、Western Blot 操作过程中的其它问题
① 上样的2个注意点
上样量要足
磷酸化蛋白的表达丰度较低，一般只有总蛋白量的10%，甚至更低，一定要确保每个凝胶孔中有足够的目的蛋白上样量。
加入磷酸化酶抑制剂
磷酸化蛋白容易脱磷酸化，除提取蛋白时要迅速小心外，也可在上样缓冲液和转移缓冲液中加入磷酸化酶抑制剂Na3VO4等。
② 封闭剂的选择
根据经验来看，WB检测磷酸化蛋白时，BSA的封闭效果比脱脂牛奶好。一般的脱脂奶粉中含有大量的酪蛋白，是一种磷酸化蛋白，如果要WB检测磷酸化蛋白的话，就最好别用脱脂奶，否则会产生高背景（当然很多人用牛奶封闭出现问题也可能是因为用了非实验级奶粉）。
③ 抗体孵育
一抗4℃过夜，二抗室温1h
因为磷酸化蛋白只占总蛋白量的极少部分，加入一抗后最好4 ℃过夜，过夜可保证充分结合进而曝出更漂亮的条带。同时4 ℃也可以使一抗重复使用多次，毕竟磷酸化抗体都挺贵的。二抗则室温1 h即可。
选择4 ℃过夜的主要原因是蛋白抗原不容易从膜上脱落。蛋白抗原在膜上靠的是物理吸附属热力学范畴，高温下容易脱落。而抗体-抗原结合是热力学与动力学问题，高温容易结合是热力学范畴，抗体、抗原浓度却是动力学范畴。膜上的抗原脱落了，结合效率会低。
抗体稀释尽量降低二抗的浓度
请务必根据产品说明书中推荐的稀释液稀释一抗，不同产品有不同最佳稀释液。
使用浓度过高的二抗可能导致与目标蛋白以外的蛋白质的非特异性结合。任何蛋白质都可能发生非特异性结合从而导致更高和更低分子量的条带出现。推荐使用1：5000-1：20000范围内的二抗稀释度。同时可以设置一个对照，就是不孵一抗，只孵二抗的对照组，从而确保抗体的特异性。
④ 关于洗脱
一定要注意，膜一定要完全泡在洗脱液中（可用较硬的塑料膜封好），然后要完全浸入水中，让膜受热均匀。这一点很重要，要不然压出来的总蛋白、内标会不均一，无法进行比较，影响我们的结果分析。
洗脱液是用来去除已结合的抗体，但也会去除部分的蛋白，导致蛋白信号变弱。实验发现水浴有时温度不稳定，温度定为55 ℃时往往其温度容易超过，导致较多的蛋白也被去除。建议温度设为50℃，30 min，既能有效去除已结合的抗体，又比55 ℃更能保护蛋白。
抗体洗脱液配方：取0.5mol/L的Tris-Hcl（pH=6.8）25ml、4g SDS和1.4ml β-巯基乙醇，加纯水定容至200mL。
⑤ 磷酸化抗体选择
区分非磷酸化的抗体和磷酸化的抗体
一般原则是非磷酸化的抗体既可以识别非磷酸化的蛋白，也可以识别磷酸化的蛋白。磷酸化的抗体只能识别磷酸化的蛋白，而不能识别非磷酸化的蛋白。当然由于抗体识别表位的原因，不排除有些非磷酸化的抗体只能识别非磷酸化的蛋白，不能识别磷酸化的蛋白。
选择对应的磷酸化位点的抗体
如IkBα的主要磷酸化位点包括S32、S36和Y42。因此在选择磷酸化抗体之前，一定要先查阅文献在你的实验条件下或者预测目的蛋白是发生哪种位点的磷酸化，或者根据磷酸激酶来判断可能的磷酸化位点。
磷酸化抗体的说明书一定要仔细看
并最好根据厂商的操作说明来操作实验，这是实验成功的保证。因为不同的磷酸化抗体公司推荐的操作步骤不同。比如CST的一些抗体是脱脂奶粉封闭，一抗、二抗用BSA配制。
最最重要的是，抗体质量一定要好，特异性强，效价高；同时是经过验证，发表过文章的抗体，这样结果自然容易很多。
3、总蛋白和内参对照都要做
① 磷酸化蛋白检测需要设置两个内参
一个是磷酸化蛋白对应的总蛋白
比如你要检测Akt磷酸化，那你就要同时跑一个Akt的蛋白和Akt磷酸化的抗体，仅仅是检测到磷酸化蛋白表达量的变化不能说明问题，只有磷酸化蛋白与总蛋白比值变化了才能说明磷酸化水平发生变化了。
检测总蛋白一方面可以验证目标蛋白在样本中是否存在；另一方面通过对蛋白总量的检测，计算磷酸化蛋白/总蛋白比例可作为蛋白质磷酸化程度的指标，来判断样本中靶标蛋白磷酸化程度，可为后续结果分析提供依据。如未检测到磷酸化信号以及靶标蛋白总量，可能是样本中没有靶标蛋白；或者根据靶标蛋白总量以及磷酸化蛋白含量，分析刺激或诱导对靶标蛋白磷酸化水平的影响。
另一个是普通内参比如actin和GAPDH等
普通内参是作为体系的对照，保证上样量一致从而排除体系本身的影响。
Western blotting检测PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT表达
DOI: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2019.06.003
② 研究总蛋白有两种方法
① 方法1：相同的样品在不同的孔中上样两次（可在相同的胶上，也可在不同的胶上），其一压磷酸化蛋白，另一压该蛋白总的表达量（包括磷酸化和未磷酸化的该蛋白），甚至还可跑另一个胶，压内标。但是一般不建议如此做，因为这样比较时误差还是较大的。
② 方法2：比较常用的方法是用洗脱液将原先结合上的磷酸化抗体及二抗洗去，然后用同一张膜压总蛋白。然后再洗脱一次，再压内标。
4、影响WB背景和条带的关键因素
① 背景颜色深
上样体积较小，导致曝光时间增加，背景颜色深。
磷酸化蛋白WB时背景也往往较深，所以压片时间要适当，不能太长或过短，太长则背景太深盖住想要的那条带，时间过短则可能没有条带或者条带太浅。
洗膜条件会影响背景：一抗和二抗均建议用1*TBST （相对于PBST缓冲液，最终信号会更强）洗膜3次，每次5min。洗膜时间不宜过长或过短，过长会导致信号减弱（抗体从结合的位点脱落），过短则会导致背景深。另外，洗膜的时候，盒子要比膜稍微大一圈，保证膜充分的在洗涤液中晃动，且建议单张洗膜而非几张一起清洗。
② 杂带、非特异性条带
杂带较多，无明显目标条带，这可能是由于将样本长期保存，其中的磷酸化蛋白已经发生降解，无法检测出目标条带。
做磷酸化蛋白WB时，除了目标蛋白的条带以外，往往会出现非特异性的条带。磷酸化抗体不好的话，甚至会压出非特异性的条带，反而没有你想要的条带，所以压片后，一定要根据Markers比对一下压出的条带分子量是否正确。
③条带很浅或者完全没有条带
有些蛋白的磷酸化很低甚至不表达，需要做刺激处理；如果再加上样品上样量较少，保存时间过长，就会影响实验结果，出现完全没有条带的情况。
组织或细胞裂解时会释放出大量内源性蛋白磷酸酶，它可以催化磷酸化蛋白的去磷酸化，所以裂解液中一定要有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，抑制磷酸化蛋白的去磷酸化，维护蛋白质的磷酸化状态。否则条带会很浅，结果也不可信。
Part.3
补充内容
WB和流式细胞术检测蛋白磷酸化的区别是什么？
流式是唯一的单细胞磷酸化分析技术，WB需要裂解细胞提取蛋白质分析。WB检测反映的是整个细胞群体蛋白质磷酸化状态的平均值，无法收集一个群体中单个细胞蛋白质磷酸化的信息，也没有能力追溯和识别磷酸化蛋白质相对应的细胞群体。
如下图所示：流式分析和WB分析的差异
(A)在这个假设的实验中，获得了三个样品，它们含有一种感兴趣的蛋白质在1,10，每个单元格10份或50份，如所示。每个细胞的蛋白质分子平均数为1，样本2和样本3均为5。
(B)当通过 Western印迹分析这些细胞群时，样品2和3将显示较暗的条带，但彼此看起来相同。
(C)然而，当用荧光标记的抗体对样品进行蛋白质染色并通过流式细胞仪进行分析时，可以清楚地看到样品2包含两个不同群体的细胞，这两个群体具有相同的代表性，而在样品3中，只有大约1/10的细胞具有较高的蛋白质水平。样品中的这种异质性可能是由于不同的细胞类型(即免疫细胞)，或者是由于全或无类型的信号反应。
DOI: 10.1016/j.clim.2003.11.009
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